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【AAV熱點(diǎn)應(yīng)用】Zetasizer精準(zhǔn)表征rAAV顆粒粒徑及衣殼滴度

更新時(shí)間：2022-06-02       點(diǎn)擊次數(shù)：1270

腺相關(guān)病毒載體表征


腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一。其直徑約為20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA。重組腺相關(guān)病毒載體（recombination AAV, rAAV）則是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的，因其具有：安全性高、免疫原性低；宿主細(xì)胞范圍廣（對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力）；體內(nèi)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)；血清型眾多，且具有組織特異性等特點(diǎn)被廣泛用于基因治療、疫苗等研究、應(yīng)用領(lǐng)域[1]。


在rAAV的生產(chǎn)工藝中，有無(wú)團(tuán)聚體（aggregate），以及衣殼滴度（titer）的高低是重點(diǎn)考察的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）[2]，Zetasizer納米粒度儀通過(guò)對(duì)rAAV顆粒的粒徑及衣殼滴度的表征，快速實(shí)現(xiàn)該CQAs的鑒定。


納米粒度電位儀

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馬爾文帕納科 Zetasizer Ultra


01

材料和方法



將兩種不同生產(chǎn)批次的rAAV分別用緩沖液稀釋至合適的濃度，利用Zetasizer Ultra-Red （Malvern Panalytical Ltd.）以及小體積石英比色皿（ZEN2112）進(jìn)行相應(yīng)的粒徑和滴度測(cè)定[3]。樣品測(cè)試體積為20 µL，rAAV折射率、吸收率分別設(shè)置為1.45和0.001，緩沖液的散射光強(qiáng)度測(cè)定為80 kcps。


02

結(jié)果


通過(guò)多角度動(dòng)態(tài)光散射（multi-angle DLS, MADLS）技術(shù)，我們分別對(duì)兩種批次的rAAV粒度大小及分布進(jìn)行表征（圖1、3）?？梢钥吹?，批次1的rAAV只有一個(gè)粒徑分布峰，其值大小為28.2 nm，說(shuō)明體系中沒(méi)有團(tuán)聚體產(chǎn)生，而批次2的rAAV則呈現(xiàn)出3個(gè)粒徑分布峰，分別位于28.2、150.9以及430.6 nm，這說(shuō)明體系中除了rAAV單體，還有團(tuán)聚體產(chǎn)生。


此外，基于MADLS技術(shù)得到的顆粒的準(zhǔn)確粒徑分布圖，我們還能得到對(duì)應(yīng)尺寸的衣殼滴度（圖2、4）。

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參考文獻(xiàn)

1. Mendell J R, Al-Zaidy S A, Rodino-Klapac L R, et al. Current Clinical Applications of in vivo Gene Therapy with AAVs. Molecular Therapy, 2021, 29 (2), 464-488.


2. Gimpel A L, Katsikis G, Sha S, et al. Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021, 20, 740-754.


3. Cole L, Fernandes D, Hussain M T, et al. Characterization of Recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) for Gene Therapy Using Orthogonal Techniques. Pharmaceutics, 2021, 13, 586.