【熱門應(yīng)用】WAVE基于GCI技術(shù)的分子相互作用動(dòng)力學(xué)分析在藥物開發(fā)中的應(yīng)用

Creoptix公司，光學(xué)生物傳感器企業(yè)，2022年加入馬爾文帕納科，擁有zhuan利的光柵耦合干涉（GCI）技術(shù)，開創(chuàng)新一代動(dòng)力學(xué)，實(shí)現(xiàn)了在更廣泛的樣品范圍內(nèi)提供更高質(zhì)量的分子結(jié)合親和力數(shù)據(jù)和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。

具備先進(jìn)的GCI技術(shù)的WAVE系列分子互作分析儀，究竟能為生物開發(fā)領(lǐng)域帶來(lái)什么樣的支持呢？他和傳統(tǒng)的分子互作技術(shù)相比又有哪些差異和優(yōu)勢(shì)呢？本文將針對(duì)以上問(wèn)題予以解答。

1. 關(guān)于光柵耦合干涉技術(shù)（GCI）

光柵耦合干涉技術(shù)（Grating-Coupled Interferometry, GCI）是一種近年發(fā)展起來(lái)的具有高靈敏度的基于芯片的非標(biāo)記生物傳感器技術(shù)，它區(qū)別于依賴熒光和免疫等標(biāo)記分子的傳統(tǒng)分子間相互作用技術(shù)。

通過(guò)一次GCI實(shí)驗(yàn)，用戶可以快速、準(zhǔn)確、可靠的獲取一整套描述分子間相互作用的信息，包括并不限于結(jié)合有無(wú)、結(jié)合特異性、描述結(jié)合強(qiáng)弱的親和力KD或鍵合常數(shù)KA、描述結(jié)合快慢與穩(wěn)定性的動(dòng)力學(xué)常數(shù)（結(jié)合速率常數(shù)ka與解離速率常數(shù)kd）、樣品活性濃度、分子間結(jié)合機(jī)制以及理論熱力學(xué)信息（范德霍夫焓變）等。GCI技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品是Creoptix WAVE系列（2022年初被馬爾文帕納科收購(gòu)作為旗下Label-Free分子互作分析平臺(tái)的一員）。

 GCI技術(shù)具有高靈敏度、分析物的分子量無(wú)下限以及捕獲快速解離動(dòng)力學(xué)等優(yōu)勢(shì)，改進(jìn)了基于片段的小分子篩選和動(dòng)力學(xué)分析，與無(wú)堵塞的流路集成芯片配合使用，加速了藥物開發(fā)的過(guò)程。

圖1 光柵耦合干涉技術(shù)（GCI）示意圖

2. 弱相互作用也能得到很好的數(shù)據(jù)

在基于片段的篩選中發(fā)現(xiàn)的弱結(jié)合物通常是根據(jù)親和力而不是動(dòng)力學(xué)進(jìn)行排名的，因?yàn)樗鼈兊慕怆x速率常數(shù)kd非?？欤@是傳統(tǒng)的SPR儀器無(wú)法解決的問(wèn)題。然而，由于具有超快速的流路切換時(shí)間，Creoptix WAVE系統(tǒng)可以提供出色的分辨率，在高達(dá)10 s-1的解離速率下仍然能夠可靠地確定動(dòng)力學(xué)，提供了一個(gè)多功能的片段藥物篩選和分析平臺(tái)。

使用4PCZ WAVE芯片固定淀粉樣纖維蛋白（Amyloid Fibrils），小分子硫黃素（ThT，319 Da）以4種濃度（50 mM ~ 6.25 mM）注入，擬合后顯示出10 s-1左右的解離速率常數(shù)。

圖2 淀粉樣纖維蛋白與硫黃素的結(jié)合分析

下圖為在PCP WAVE芯片上捕獲的6-mer寡核苷酸（1.7 kDa）與其互補(bǔ)的ssDNA結(jié)合的傳感圖，擬合后顯示出10 s-1左右的解離速率常數(shù)。

圖3 寡核苷酸與其互補(bǔ)的ssDNA的結(jié)合分析

3. 創(chuàng)新的waveRAPID技術(shù)

加快藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段對(duì)于更快地將新藥送到患者手中至關(guān)重要。為了滿足用戶需求，Creoptix推出了測(cè)量動(dòng)力學(xué)的新方法。在傳統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，分析物以不斷增加的濃度被注入，每次注射的持續(xù)時(shí)間一樣。然而，Creoptix創(chuàng)新的waveRAPID （Repeated Analyte Pulses of Increasing Duration）技術(shù)通過(guò)以不同時(shí)長(zhǎng)注入單一濃度的分析物，不斷增加在芯片表面的脈沖時(shí)間來(lái)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，該方法免去了濃度梯度的稀釋步驟，大大減少了人為稀釋誤差和實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備時(shí)間。

圖4 waveRAPID與傳統(tǒng)動(dòng)力學(xué)的方法比較

用waveRAPID和傳統(tǒng)的多循環(huán)動(dòng)力學(xué)測(cè)量小分子化合物FUR（分析物）與碳酸酐酶CAII（配體）的結(jié)合。使用WAVEcontrol軟件的“Direct Kinetics"分析，兩種方法都能提供高度一致的結(jié)果。

圖5 waveRAPID與傳統(tǒng)動(dòng)力學(xué)的數(shù)據(jù)比較

使用waveRAPID技術(shù)，在18小時(shí)內(nèi)完成了對(duì)90個(gè)小分子的動(dòng)力學(xué)分析，圖中顯示的結(jié)果為篩選過(guò)的具有低統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差的速率常數(shù)，突出展示了三種不同結(jié)合強(qiáng)度的相互作用的傳感圖和擬合圖。

圖6 小分子藥物苗頭化合物的waveRAPID動(dòng)力學(xué)篩選

結(jié)論

Conclusion

通過(guò)Creoptix WAVE所提供的親和力和動(dòng)力學(xué)信息能夠表征藥物結(jié)合的詳細(xì)動(dòng)力學(xué)機(jī)制，為開發(fā)具有高選擇性的藥物提供了理論基礎(chǔ)，使得未來(lái)藥物設(shè)計(jì)中的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)更加合理化。提高通量是藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中經(jīng)常提到的需求，使用waveRAPID技術(shù)大大縮短了總測(cè)量時(shí)間，在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] Kartal O, Andres F, Lai MP, et al. waveRAPID-A Robust Assay for High-Throughput Kinetic Screens with the Creoptix WAVEsystem. SLAS Discov. 2021; 26(8): 995-1003.

[2] FitzGerald EA, Butko MT, Boronat P, et al. Discovery of fragments inducing conformational effects in dynamic proteins using a second-harmonic generation biosensor. RSC Adv. 2021; 11(13): 7527-7537.